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がんリンパ節転移診断システム(OSNA法) 遺伝子増幅検出装置 RDシリーズ RD-200、RD-100i

特長

「OSNA™」と「現行法」の違い

現行法による検査の場合

病理組織調査

【病理組織調査】
手術中に病理医が
顕微鏡でがん細胞の有無を確認

病理組織学的アプローチであるこれまでの方法では、専門病理医の技術や経験に頼るところが大きく、限られた時間での検査には施設間差があるといわれています。

課題とされる点:
  • リンパ節の一部のみの検査のため、がん転移を見つけられない場合がある
  • 手術中という限られた時間でのきめ細かな観察が必要
  • 正確な判定には、専門病理医の技術と経験が必要

OSNA™法による検査の場合

現行法による検査の場合

現行法による検査の場合OSNA®法(直接遺伝子増幅法)

【OSNA®法(直接遺伝子増幅法)】
専用の装置と試薬で
がん細胞の遺伝子を増幅して測定

リンパ節全体を可溶化して検査するため、より正確な判定が可能です。検査開始から完了まで約30~40分と術中検査に使用できます。また、検査を自動化できるため、病理医の手技や熟練度による施設間差を解消することができます。

所要時間:約30~40分
メリット:

  • リンパ節全体を検査するため、より高精度に判定が可能
  • 短時間で検査結果を得られるため、手術中の検査が可能
  • 検査を自動化できるため、測定方法の施設間差を解消

標的遺伝子の検出方法

リアルタイム濁度検出

OSNA™法で遺伝子増幅法として採用しているRT-LAMP法*では、標的遺伝子の遺伝子増幅に伴い反応副産物としてピロリン酸マグネシウムが析出します。専用の解析装置RD-100iは、この反応副産物の析出による濁度の変化をリアルタイムに検出しています。
リアルタイム濁度検出
RT-LAMP法(Reverse Transcript Loop-Mediated Isothermal Amplification method)
当社はLAMP法の使用に関して栄研化学株式会社と2001年1月に実施権の許諾契約を締結しております。

mRNA濃度と立ち上がり時間との関係

リアルタイム検出している濁度がある閾値(0.1)に達した測定時間を「立ち上がり時間」としています。この「立ち上がり時間」はmRNA濃度(copies/μL)と相関関係があるため、予めmRNA濃度既知のキャリブレーターを用いて検量線を作成する事で、未知の測定サンプルの「立ち上がり時間」からmRNA濃度の定量が可能です。

RT-LAMP法の増幅曲線

mRNA濃度(copies/μL)が高いほど立ち上がり時間が早い
RT-LAMP法の増幅曲線

「立ち上がり時間」とmRNA濃度の関係

mRNA濃度(対数値)と「立ち上がり時間」は直線関係となり、これを検量線として測定サンプル中のmRNA濃度を算出します。

※実際には濃度既知の3点のキャリブレーターを用いて検量線を作成します。

「立ち上がり時間」とmRNA濃度の関係

遺伝子マーカーの選択

乳がん

乳がんのリンパ節転移検出に適切なマーカーを選択するため、以下の検討を行いました。

1次スクリーニング

National Center for Biotechnology Information が提供するヒト遺伝子発現データベースより、乳腺組織及び乳がん組織において発現が高く、他方リンパ節組織においては発現が低い上位45個の遺伝子を抽出しました。

2次スクリーニング

1次スクリーニングより選択した45遺伝子にて、実際の乳がん患者リンパ節での発現状態を定量RT-PCR法により測定しました。結果として、転移陽性リンパ節と転移陰性リンパ節での発現量の差が明確なCK19を含む7遺伝子を選択しました。

比較

2次スクリーニングで選択した7候補遺伝子について、定量RT-PCR法で得られた結果から、乳がん患者のリンパ節での発現レベル及びばらつきの程度を比較しました。
結果として、転移陽性と転移陰性のリンパ節における発現量分布が明らかに異なるのは、CK19、FOXA1及びSPDEFの3遺伝子でした。それらの内、 CK19mRNAの転移陽性リンパ節中における発現量が最も高く、FOXA1及びSPDEFのそれぞれと比較しても明らかに優位なものでした。この事から、発現量の高いCK19mRNAを最適な標的遺伝子マーカーとして選択しました。
乳がん患者のリンパ節での発現レベル及びばらつきの程度の比較

大腸がん

大腸がんリンパ節転移検出に適切なマーカーを選択するため、以下の検討を行いました。

1次スクリーニング

97遺伝子
ヒト・ゲノムライブラリー430万遺伝子からの検索

2次スクリーニング

10遺伝子
大腸がんリンパ節転移陽性・陰性溶液を用いた定量RT-PCR法による検索

3次スクリーニング

2遺伝子
大腸がんリンパ節を用いた定量RT-PCR法による検討

4次スクリーニング

最適マーカー遺伝子
大腸がんリンパ節を用いたOSNA™法による検討
ヒト遺伝子発現データベースより大腸組織および大腸がん組織に特異的に発現している97遺伝子を選択した後、定量RT-PCR法による検討とOSNA™による検討を行い、転移陽性リンパ節における発現量が高く、かつ、転移陽性リンパ節と転移陰性リンパ節での発現量において大きな差を示したCK19mRNAを大腸がんリンパ節転移検査における最適なマーカー遺伝子として選択しました。

胃がん

胃がんリンパ節転移検出に適切なマーカーを選択するため、以下の検討を行いました。

1次スクリーニング

58遺伝子
ヒト・ゲノムライブラリー430万遺伝子からの検索

2次スクリーニング

6遺伝子
胃がんリンパ節転移陽性・陰性溶液を用いた定量RT-PCR法による検索

3次スクリーニング

2遺伝子
胃がんリンパ節を用いた定量RT-PCR法による検討

4次スクリーニング

最適マーカー遺伝子[CK19]
胃がん原発巣を用いた免疫染色法による検討
ヒト遺伝子発現データベースより胃組織および胃がん組織に特異的に発現している58遺伝子を選択した後、定量RT-PCR法による検討を行い、転移陽性リンパ節における発現量が高く、かつ、転移陽性リンパ節と転移陰性リンパ節での発現量において大きな差を示したCK19とCEAを候補遺伝子として選択しました。さらに、2候補遺伝子について、原発巣中のタンパク質発現の検討により、より発現頻度の高いCK19mRNAを胃がんリンパ節転移検査における最適なマーカー遺伝子として選択しました。

非小細胞肺がん

非小細胞肺がんのリンパ節転移検出に適切なマーカーを選択するため、以下の検討を行いました。

1次スクリーニング

22遺伝子
ヒトDNAマイクロアレイ遺伝子発現データベースからの検索

2次スクリーニング

最適マーカー遺伝子
肺がんリンパ節を用いた定量RT-PCR法による検討
ヒト遺伝子発現データベースより、肺がん組織と正常リンパ節におけるmRNA発現量の差が100倍以上であった遺伝子を探索、抽出し、22遺伝子を選択した後、定量RT-PCR法による検討を行い、転移陽性リンパ節における発現量が高く、かつ、転移陽性リンパ節と転移陰性リンパ節での発現量において大きな差を示したCK19を、肺がんリンパ節転移検査における最適なマーカー遺伝子として選択しました。

カットオフの設定

乳がん

乳がんリンパ節転移の陽性・陰性を判定するためのカットオフ値を設定する目的で、病理組織検査により判定された転移陽性リンパ節・転移陰性リンパ節のCK19mRNAの濃度をOSNA™で測定しました。 その結果、OSNA™での転移陰性と転移陽性のカットオフ値を2.5×102copies/μLに設定しました。また、2mm角相当の転移巣中のCK19mRNA発現量に基づいて、2mm角以上の転移巣を示唆するカットオフ値として5.0 x 103copies/μLを設定しました。
乳がん

大腸がん

大腸がんリンパ節転移の陽性・陰性を判定するためのカットオフ値を設定する目的で、病理組織検査により判定された転移陽性リンパ節・転移陰性リンパ節のCK19mRNAの濃度をOSNA™で測定しました。 その結果、OSNA™での転移陰性と転移陽性のカットオフ値を2.5×102copies/μLに設定しました。
大腸がん

胃がん

胃がんリンパ節転移の陽性・陰性を判定するためのカットオフ値を設定する目的で、病理組織検査により判定された転移陽性リンパ節・転移陰性リンパ節中のCK19mRNAの濃度をOSNATMにより測定しました。その結果、OSNATMでの転移陰性と転移陽性のカットオフ値を2.5×102copies/μL に設定しました。
胃がん

非小細胞肺がん

肺がんリンパ節転移のカットオフ値を設定する目的で、OSNATM法により、転移陰性リンパ節・転移陽性リンパ節中のCK19mRNAの濃度を測定し、比較しました。その結果、転移陰性と転移陽性のカットオフ値を2.5×102copies/μLに設定しました。
非小細胞肺がん